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參考價	面議

蛋白質生物學

蛋白提取和裂解

細胞器分離

蛋白純化

蛋白質濃縮和緩沖液置換

蛋白定量

蛋白凝膠電泳

免疫組織化學

貝博生物

產品概述 product description 貝博® BBproExtra® 細胞膜蛋白/胞漿蛋白/核蛋白提取試劑盒適用于從各種原代或傳代細胞中分步提取膜蛋白/胞漿蛋白/核蛋白。提取過程簡單方便，可在1小時內完成。本試劑盒含有的配方能夠有效溶解細胞膜組份，包括細胞質膜、核膜和各種細胞器膜。本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質電泳、免疫沉淀、ELISA、轉錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實驗、酶活性測定等下游蛋白研究實驗。本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構象的活性蛋白。本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應用兼容。

詳細介紹

保存溫度

2-8℃

注意事項

1.蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。
3.試劑拆封后請盡快使用完！

有效期

一年

檢測方法

WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等

適用樣本

動物細胞

產品特點

1.使用方便，從細胞，組織中提取蛋白不需經過研磨、反復凍融、超聲破碎等前處理。
2.將蛋白提取的時間縮短至1小時。
3.含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。
4.紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。
5.蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括蛋白酶、半酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

產品應用

WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等

儀器準備

1.離心機
2.振蕩器
3.勻漿機/勻漿器
4.渦旋混勻器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

試劑準備

1.PBS緩沖液
2.蛋白定量試劑盒

耗材準備

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套

使用注意事項

使用注意事項：
? 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
? 蛋白酶抑制劑在2-8℃時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。
? 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
? 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
? 如果試劑盒不能短時間內用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。
? 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。
? 下游實驗如果是進行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測，提取液可以不加蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，注意提取過程保持低溫操作，縮短離心時間。

使用方法

1. 提取液制備：
每400ul冷的蛋白提取液A/B/D中都分別加入2ul蛋白酶抑制劑混合物和2ul磷酸酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取5-10×106個細胞，在4℃，800×g條件下離心5-10分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干。
3. 用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4. 每5×106個細胞中加入400ul冷的蛋白提取液A，混勻后，在4℃條件下用試劑盒所配針筒反復吸吹細胞，使細胞破裂。
5. 在4℃，1000×g條件下離心5分鐘。
6. 將上清（I）吸入另一干凈離心管，在沉淀中加入100-200μl冷的提取液B，高速渦旋振蕩15秒，充分混勻。
7. 將混勻的提取液B置4℃低速振蕩30-40分鐘。
8. 在4℃，12000×g條件下離心10分鐘。將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。
9. 在步驟6中所得到的上清（I）中加入8ul提取液C，充分混勻。
10. 在2-8℃振蕩20-30分鐘。
11. 在37℃水浴10分鐘。
12. 在37℃下 1000g離心3分鐘，此時溶液分為兩層，上層是胞漿蛋白部分，下層部分（II）是膜蛋白約為40-50μl。
13. 將上層小心吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到胞漿蛋白。
14. 用50-100μl冰冷的提取液D溶解步驟12中的下層部分（II），即得膜蛋白。
15. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。

常見問題分析

1.蛋白濃度低？
處理部分樣本時可能沒有裂解，導致核蛋白/膜蛋白濃度低。只要適當延長試劑BC的處理時間即可。在持續振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
膜蛋白豐度較低，在條件允許的情況下，需要盡可能加大細胞的上樣量。

2.用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

3.提取時出現膠狀沉淀？
核蛋白提取液處理產物中有時會出現少量透明膠狀物，屬正常現象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。不檢測和基因組DNA結合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進行后續實驗即可；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續實驗。檢測一些常見的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，不必進行超聲處理。

參考文獻

1.Huimin Cao, Li Wang, Beibei Chen, et al.
DNA Demethylation Upregulated Nrf2 Expression in Alzheimer’s Disease Cellular Model
Front Aging Neurosci 2015 （IF=4.348）

2.Guang Yu, Tonghai Yan, Ye Feng, et al.
Ser9 phosphorylation causes cytoplasmic detention of I2PP2A/SET in Alzheimer disease
Neurobiology of Aging 2013 （IF=6.189）

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