小鼠胚胎肢芽間充質干原代細胞

小鼠胚胎肢芽間充質干細胞分離自胚胎肢芽；胚胎肢芽存在于兩棲類以上的大多數脊椎動物胚胎中，在四肢發生的初期階段，在身體兩側有呈芽狀的突起，內部是中胚層側板的體壁板垱厚形成，表面有表皮覆蓋。在這個中胚層區肢芽迅速伸長，不久，在其前端即見有指的突起。在此時期間，其內部的中胚層分化成軟骨、肌肉等。這些分化組織，在將肢芽作分離培養的時候也可以獲得。根據對兩棲類的有尾類的研究，作為肢原基各部的胚發能力，肢芽物質的大部分是位于背半部，而前半部主要參與基部形成，后半部參與前端的形成。在實驗上，即使將肢的原基分成二半，每一半調整好都可形成基本上近于正常形態的肢體，而且肢體各軸的極性和側性也逐漸決定。間充質干細胞（MSC）是屬于中胚層的一類多能干細胞，主要存在于結締組織和器官間質中，是具有高度自我更新和多向分化潛能的干細胞；這些細胞可以通過分裂維持自身細胞的特性和數量，并在特定條件下轉變成為一種或多種構成機體組織或器官的細胞，從而在組織修復等方面發揮積極作用。

產品名稱：小鼠胚胎肢芽間充質干細胞

組織來源：胚胎

產品規格：5×10?Cells/T25培養瓶

培養基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態：成纖維細胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

小鼠胚胎肢芽間充質干細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的佳培養狀態。

方法簡介

實驗室分離的小鼠胚胎肢芽間充質干采用-膠原酶聯合消化法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的小鼠胚胎肢芽間充質干經CD90免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培 養過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養基，培養過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養。

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于 37℃培 養箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養 瓶后加少量培養基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細胞凍存時，棄去培養基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養基終止消化，可使用血球計數板計數。