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細胞屬性：

方法簡介

公司實驗室分離的小鼠骨內膜間充質干采用沖洗骨髓、消化骨內膜、差速貼壁法結合培養基篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

公司實驗室分離的小鼠骨內膜間充質干經CD29、CD44免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

小鼠骨內膜間充質干細胞分離自股骨、脛骨；骨內膜是一層致密結締組織膜，覆蓋在骨的表面（關節面除外），新鮮骨內膜呈粉紅色，含有豐富的血管、和成骨細胞。此外，附著于骨的肌腱、韌帶于附著部位都與骨內膜編織在一起。因而骨內膜與骨質結合甚為牢固。骨內膜富含血管、，通過骨質的滋養孔分布于骨質和骨髓。骨內膜分內、外兩層，外層主要是粗大的膠原纖維束，部分纖維穿入骨質，使骨內膜固定于骨面；內層疏松，含成骨細胞和破骨細胞（分別具有產生新骨質和改建骨的功能）。骨髓腔和骨松質的網眼也襯著一層菲薄的結締組織膜，叫做骨膜。骨內膜的內層和骨膜有分化成骨細胞和破骨細胞的能力，以形成新骨質和破壞、改造已生成的骨質，所以對骨的發生、生長、修復等具有重要意義。骨內膜間充質干細胞是一種具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，可以向骨、軟骨、肌組織、皮膚、脂肪、等多種組織分化，因此可以作為組織工程中的種子細胞。骨內膜間充質干細胞的體外培養條件要求較高，在培養過程中，受貼壁時間、種植密度、血清含量、培養溫度和培養基pH值等條件的影響。

培養信息：

培養基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%

培養條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

公司產品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。