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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的兔淋巴結淋巴采用分離淋巴結組織、研磨獲取單細胞懸液后通過密度梯度離心法制備而來，細胞總量約為1×106cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的兔淋巴結淋巴經過檢測，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

兔淋巴結淋巴細胞分離自淋巴結；淋巴結是哺乳類的周圍淋巴器官，由淋巴細胞集合而成。呈豆形，位于淋巴管行進途中，是產生免疫應答的重要器官之一。淋巴結表面包有被膜，被膜的結締組織伸入淋巴結內形成小梁，構成淋巴結的支架。被膜下為皮質區，淋巴結的中心及門部為髓質區。皮質區有淋巴小結、彌散淋巴組織和皮質淋巴竇（簡稱皮竇），髓質包括由致密淋巴組織構成的髓索和髓質淋巴竇（簡稱髓竇）。淋巴竇的竇腔內有許多淋巴細胞和巨噬細胞，從輸入淋巴管流來的淋巴液先進入皮竇再流向髓竇，后經輸出淋巴管離開淋巴結。淋巴結的主要功能是濾過淋巴液，產生淋巴細胞和漿細胞，參與機體的免疫反應。淋巴結腫大或疼痛常表示其屬區范圍內的器官有炎癥或其他病變。主要功能是濾過淋巴液，產生淋巴細胞和漿細胞，參與機體的免疫反應；當局部感染時，細菌、病毒或癌細胞等可沿淋巴管侵入，引起局部淋巴結腫大。如該淋巴結不能阻止和消滅它們，則病變可沿淋巴管的流注方向擴散和轉移。淋巴結淋巴細胞是白細胞的一種，由次級淋巴器官淋巴結產生，是機體免疫應答功能的重要細胞成分；細胞為圓形細胞核，細胞質少。成熟淋巴細胞需依賴抗原刺激而分化增殖，繼而發揮其免疫功能。

培養信息：

培養基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：懸浮

細胞形態：圓形

傳代特性：不增殖；不傳代

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔淋巴結淋巴細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的佳培養狀態。

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。

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