兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干原代細胞公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代肌腱干細胞 小鼠成纖維細胞 英文名稱： 3T3 人表皮角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)試劑盒 人表皮角質(zhì)形成細胞培養(yǎng) 大鼠腸粘膜上皮細胞培養(yǎng)基 100mL 星形膠質(zhì)細胞--腦干 大鼠原代羊膜上皮細胞

兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干原代細胞

兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞分離自股骨、脛骨；骨內(nèi)膜是一層致密結締組織膜，覆蓋在骨的表面（關節(jié)面除外），新鮮骨內(nèi)膜呈粉紅色，含有豐富的血管、和成骨細胞。此外，附著于骨的肌腱、韌帶于附著部位都與骨內(nèi)膜編織在一起。因而骨內(nèi)膜與骨質(zhì)結合甚為牢固。骨內(nèi)膜富含血管、，通過骨質(zhì)的滋養(yǎng)孔分布于骨質(zhì)和骨髓。骨內(nèi)膜分內(nèi)、外兩層，外層主要是粗大的膠原纖維束，部分纖維穿入骨質(zhì)，使骨內(nèi)膜固定于骨面；內(nèi)層疏松，含成骨細胞和破骨細胞（分別具有產(chǎn)生新骨質(zhì)和改建骨的功能）。骨髓腔和骨松質(zhì)的網(wǎng)眼也襯著一層菲薄的結締組織膜，叫做骨膜。骨內(nèi)膜的內(nèi)層和骨膜有分化成骨細胞和破骨細胞的能力，以形成新骨質(zhì)和破壞、改造已生成的骨質(zhì)，所以對骨的發(fā)生、生長、修復等具有重要意義。骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞是一種具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，可以向骨、軟骨、肌組織、皮膚、脂肪、等多種組織分化，因此可以作為組織工程中的種子細胞。骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)條件要求較高，在培養(yǎng)過程中，受貼壁時間、種植密度、血清含量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH值等條件的影響。

產(chǎn)品名稱：兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞

組織來源：股骨、脛骨

產(chǎn)品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

方法簡介

公司實驗室分離的兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干采用沖洗骨髓、消化骨內(nèi)膜、差速貼壁法結合培養(yǎng)基篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干經(jīng)CD90免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。