IL-4/IL-13響應(yīng)型STAT6熒光素酶報告基因HEK293細胞系是一種穩(wěn)定整合了受STAT6響應(yīng)元件控制的螢火蟲熒光素酶報告基因和人類STAT6（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6）的HEK293細胞系，形成了一個w全功能的STAT6信號通路。該細胞系已通過人類IL-4（白細胞介素-4）和IL-13（白細胞介素-13）的激活實驗以及使用抗IL-4R和抗IL-13R拮抗劑進行了驗證。

背景

轉(zhuǎn)錄因子STAT6（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6）在免疫細胞中扮演著至關(guān)重要的角色。IL-4激活的STAT6信號對于Th2分化和免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換是必需的，它還介導(dǎo)巨噬細胞中炎癥增強子的直接抑制。STAT6參與過敏性炎癥疾病的多個方面，如氣道高反應(yīng)性、嗜酸性粒細胞浸潤和肥大細胞反應(yīng)。STAT6主要被IL-4和相關(guān)的IL-13激活，它們具有重疊的生物學(xué)特性。當IL-4和IL-13結(jié)合時，由IL-4Ralpha和IL-13Ralpha1組成的受體復(fù)合物激活與受體相關(guān)的Janus激酶（JAK1和Tyk2），從而導(dǎo)致STAT6的激活。激活的STAT6形成同源二聚體，轉(zhuǎn)移到細胞核中，在那里它們結(jié)合響應(yīng)基因的啟動子，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄。盡管這兩種細胞因子都激活STAT6信號，但已證明IL-4在啟動這一信號通路方面比IL-13更有效。STAT6通路的功能障礙會導(dǎo)致過敏反應(yīng)（哮喘、特應(yīng)性皮炎、食物過敏）和癌癥（霍奇金病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和濾泡性淋巴瘤）。STAT6可以作為診斷和預(yù)后工具。抑制劑已被證明可以減少動物模型中的急性炎癥，未來的發(fā)展可能會導(dǎo)致新的針對STAT6相關(guān)病理的治療工具。

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應(yīng)用

? 篩選和表征STAT6信號通路的激活劑或抑制劑。

? 篩選抗IL-4、抗IL-4R、抗IL-13或抗IL-13R抗體。

細胞解凍

1. 在37°C水浴中搖晃裝有冷凍細胞的小瓶大約60秒。細胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部內(nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10 ml預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1的試管中。

注意：在37°C水浴中放置細胞過久將導(dǎo)致活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細胞在5 ml預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1中重懸。

3. 將重懸的細胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時后，檢查細胞附著和活性。更換培養(yǎng)基為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細胞準備好傳代。

5. 細胞應(yīng)在w全融合前傳代。在s次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長培養(yǎng)基1M。

細胞傳代

1. 抽去培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05% y酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養(yǎng)基1M并轉(zhuǎn)移到試管中。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細胞在生長培養(yǎng)基1M中重懸。

4. 按照推薦的亞培養(yǎng)比例1:5至1:10，每周一次或兩次將細胞種入新的培養(yǎng)容器中。

注意：解凍后和細胞密度低時，細胞可能生長速度較慢。在這些情況下，建議以1/4的比例分離細胞。經(jīng)過幾次傳代后，細胞生長速度加快，可以使用更高的比例分離細胞。

細胞冷凍

1. 抽去培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細胞，并用0.05% y酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養(yǎng)基1M并計數(shù)細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細胞在4°C冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸，細胞濃度約為2 x 10^6個細胞/ml。

4. 將1 ml的細胞懸浮液分裝到每個冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下保存過夜。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中長期保存。

注意：建議在早期傳代時擴增細胞并至少冷凍10個小瓶以備將來使用。

圖1：IL-4/IL-13響應(yīng)型STAT6熒光素酶報告基因HEK293細胞系對人類IL-4和IL-13的反應(yīng)。

IL-4/IL-13響應(yīng)型STAT6熒光素酶報告基因HEK293細胞與不同濃度的人類IL-4（左圖）和IL-13（右圖）共培養(yǎng)6小時。使用ONE-Step?熒光素酶檢測系統(tǒng)測量熒光素酶活性。結(jié)果以STAT6熒光素酶報告基因表達的誘導(dǎo)倍數(shù)顯示，與無激動劑的細胞活性相對比。

文獻參考：

Kasaian MT., et al., 2013. Am J Respir Cell Mol Biol. 49(1):37-46.

Czimmerer Z., et al., 2018. Immunity 48(1):75-90.e6. 

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