OligoGreen ssDNA定量試劑是一種超敏感的熒光核酸染料，用于定量溶液中的寡核苷酸和單鏈DNA（ssDNA）。短的合成寡核苷酸在許多分子生物學技術中被使用，如DNA測序、定點突變、DNA擴增和原位雜交。然而，傳統的寡核苷酸定量方法不夠敏感，通常需要高濃度的樣品。目前特別常用的寡核苷酸和ssDNA濃度測量方法是通過測量在260 nm處的吸光度（A260）。吸光度法的主要缺點是核苷酸對信號的顯著貢獻、核酸制備中常見污染物的干擾以及測量的相對不敏感性（0.1 A260大約相當于3μg/mL的合成24堿基M13測序引物）。相比之下，

Biogradetech OliGreen ssDNA定量試劑可以使研究人員使用標準熒光分光光度計和熒光激發和發射波長將寡核苷酸或ssDNA定量至低至100 pg/mL（在2 mL檢測體積中為200 pg）。這種敏感性比吸光度法高出10,000倍。使用熒光微孔板閱讀器，我們可以檢測到低至1 ng/mL（在200 μL檢測體積中為200 pg）的寡核苷酸或ssDNA。

Biogradetech還使用OliGreen試劑定量了幾個ssDNA樣品，包括M13和fX174病毒DNA以及變性的牛胸腺DNA，并獲得了類似的敏感性。OliGreen試劑可以檢測到從100 pg/mL到1 μg/mL的寡核苷酸濃度范圍。此外，Biogradetech已經證明，OliGreen試劑的線性在存在各種潛在化合物的情況下仍然穩健，包括鹽、尿素、乙醇、氯仿、洗滌劑、蛋白質、ATP和瓊脂糖；長度為六個堿基或更少的短寡核苷酸不會干擾定量測量。

艾美捷OligoGreen ssDNA定量試劑盒*2000次* 基本參數：

目錄號：B-CHK002

規格：1mL

儲存：在-20°C下儲存

OligoGreen ssDNA定量試劑盒推薦的步驟：

該實驗步驟適用于具有2 mL檢測體積的標準熒光比色皿。如果在微孔板中進行分析，請相應調整所示的體積。例如，建議使用200 μL體積的96孔微孔板。

1. TE緩沖液的制備

準備TE稀釋緩沖液，由10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5組成，用于稀釋OliGreen試劑和寡核苷酸/ssDNA樣品。由于OliGreen試劑是一種高靈敏度的ssDNA檢測試劑，使用不含有核酸污染的TE溶液非常重要。OliGreen ssDNA定量試劑盒中包含的20倍濃縮TE緩沖液不含核酸酶和核酸。通過將濃縮緩沖液以20倍稀釋在不含DNA酶的無菌蒸餾水中，制備1X TE工作液。

2. OliGreen工作液的制備

在實驗開始前，通過將濃縮的DMSO溶液以200倍稀釋在10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5（TE緩沖液）中，制備OliGreen試劑的水溶性工作液。例如，為了準備足夠分析20個樣品的工作液，將100 μL的OliGreen定量試劑加入19.9 mL的TE緩沖液中。建議使用塑料容器而不是玻璃容器來制備該溶液，因為試劑可能吸附在玻璃表面上。由于OliGreen試劑對光敏感，應通過用鋁箔覆蓋或存放在黑暗的地方來保護工作液。為了獲得最佳結果，應在制備后幾個小時內使用該溶液。

3.寡核苷酸標準品的制備

3.1在TE beffer中制備濃度為2μg/mL的寡核苷酸儲備溶液。基于260nm處的吸光度，在具有1cm路徑長度的比色皿中測量寡核苷酸的濃度（A260）。1.0的AnA260對應于寡核苷酸溶液的濃度為30-35μg/mL。

3.2對于高范圍標準曲線，如表2所示，將2μg/mL寡核苷酸儲備溶液稀釋到一次性試管（或用于轉移到石英試管的塑料管）中。然后將1.0 mL OliGreenreagent水溶液加入每個試管中。充分混合，在室溫下孵育2-5分鐘，避光3.3培養后，使用熒光分光光度計或熒光微板讀取器在標準熒光波長（激發~480 nm，發射~520 nm）下測量樣品的熒光。

3.4從每個樣品的熒光值中減去空白的熒光值。使用校正的數據生成熒光與寡核苷酸濃度相關的標準曲線（圖1）。3.5對于低范圍標準曲線（從100 pg/mL到50 ng/mL），將100 ng/mL低聚核苷酸儲備溶液（在步驟1.1中制備）稀釋到一次性試管（或轉移到石英試管的塑料管）中

4.樣品分析

4.1在一次性試管中，將TE緩沖液中的實驗寡核苷酸溶液稀釋至1.0 mL的最終體積。您可能需要為多個實驗樣品準備稀釋液。高度稀釋樣品有助于減少某些污染物的干擾。但是，避免使用極小的樣品體積，因為它們很難準確地移液。

4.2向每個樣品中加入1.0 mL OliGreen工作溶液。在室溫下培養2-5分鐘，避免暴露在光下。

4.3使用與生成標準曲線相對應的儀器參數測量樣品的熒光（參見步驟3.3和3.5）。為了最大限度地減少光漂白效應，保持所有樣品的熒光測量時間一致。

4.4從每個樣品的熒光值中減去空白的熒光值。根據標準曲線測定寡核苷酸的濃度。

4.5使用不同稀釋度的試劑重復測量樣品，以確認定量結果。

文獻參考：

1. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7,133（1997）; J Chromatogr A 755,271（1996）

該試劑僅用于科學研究領域，不適用于臨床診斷或其他用途。