支原體qPCR法介紹：
熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對(duì)支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，簡(jiǎn)稱qPCR。
優(yōu)點(diǎn)：
①靈敏度高、特異性強(qiáng)。
②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果
③檢測(cè)結(jié)果可定量
④操作簡(jiǎn)便
缺點(diǎn)：
①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）
②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。
操作步驟
第1步：樣本處理
a.細(xì)胞培養(yǎng)上清
b. 生物藥或需遵循藥典的樣本
說(shuō)明：①樣品基質(zhì)可能會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測(cè)定靈敏度。
②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測(cè)靈敏度。
建議：樣本做DNA抽提處理，實(shí)現(xiàn)最高靈敏度。
推薦：德國(guó)MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒
Venor® Gem Sample Preparation Kit
該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過(guò)廣泛驗(yàn)證。
第2步：試劑制備
a.凍干粉溶解
b. 反應(yīng)體系制備
b1) 樣品為細(xì)胞上清篩查——反應(yīng)體系制備
b2) 樣品為生物藥——反應(yīng)體系制備
第3步：?jiǎn)?dòng)熒光定量PCR儀
第4步：結(jié)果判別
FAM通道：檢測(cè)支原體熒光信號(hào)。HEX通道：檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照熒光信號(hào)。
支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號(hào)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。
支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號(hào)越高，檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照的HEX通道信號(hào)越低。
定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Ct＜40為陽(yáng)性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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