離子交換層析的洗脫會受到線性或分步鹽梯度或置換展開的影響。一般最好先采用線性的鹽梯度洗脫，維持梯度約10個柱體積。在zui簡單的情況下，梯度操作需兩種緩沖液，平衡緩沖液（buffer A）和用于加載相反電荷離子所用緩沖液（buffer B）。大多數情況下，并不需要后半段的梯度，因為多數蛋白質都可以在150-500nmol/L鹽濃度下從傳統的離子交換劑上洗脫下來。所以，通常最大梯度到50%足矣。
分步洗脫也可通過buffer A和buffer B實現。也應該意識到也許永遠都不會獲得一種理想的適用于層析柱的分步洗脫。首先，鹽滯留以及HPLC的盲端體積都是決定取樣時間的因素；其次，因為緩沖液混合器的特性，僅能獲得S形曲線。根據分步洗脫中選擇的鹽濃度，蛋白質會隨著鹽峰前端移動或移至鹽峰前端的后方。Yamamoto等將其命名為Ⅰ型或Ⅱ型洗脫。當濃縮的洗脫物被沖洗出來之后，所選擇的鹽濃度必須適于Ⅰ型洗脫。此時的鹽濃度可能要比相應采用線性梯度洗脫所達到的最大鹽濃度高一些。Ⅰ型洗脫所需的緩沖液小于1個柱體積。
pH梯度洗脫更難于優化。所以，最好首先根據蛋白質的pI找到一種條件——此時蛋白質不與離子交換劑結合。若低于pI，宜采用陰離子交換劑；若高于pI，宜采用陽離子交換劑。因此必須降低或提高pH。請記住，離子交換劑本身相當于一種酸或堿，生成pH梯度應遵循 滴定曲線。要獲得線性的pH梯度是十分困難的，但是采用含有二元醇的硼酸鹽緩沖液可以實現，如甘露醇。第四種洗脫方式是采用手動調節pH梯度進行洗脫。當采用10mmol/L的較低濃度緩沖液洗脫時，使用鹽可以導致pH梯度，這種梯度的形成是因為不同種類鹽移動情況不同。這種手動調節的pH梯度，可以用于高分辨率，另外也有利于蛋白質峰集中。這種情況下，也需要數個柱體積的緩沖液。
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