蛋白質結合于填料之后，必須再將目標蛋白質洗脫，并收集層析柱柱后的流出液。多數情況下，洗脫過程用于將不需要的蛋白質從目標蛋白質中分離或者去除。不需要的蛋白質可能與填料結合的不是那么緊密，因而會先于目標蛋白質被洗脫。另外一些情況下，不需要的蛋白質會與填料結合更加緊密，并會在目標蛋白被洗脫之后仍與填料結合。這種情況通常發生在疏水層析法（HIC）分離蛋白質多聚體時，目標蛋白多聚體與填料的結合比單體與填料的結合更加緊密。在洗脫過程中，流出液組分可能含有高純度產品，但在其之前或之后也會含有大量的不需要的蛋白質雜質。洗脫過程（梯度洗脫）如圖所示，該圖說明用HIC分離純化時，在洗脫步驟中，應將柱后流出液進行等份收集，這樣才可以獲得適宜純度的產品。
洗脫過程可采用等度或梯度的方式進行。4種最常見的洗脫結合蛋白質的方法如下：
1、降低鹽濃度（相對于結合條件）
鹽濃度的降低會相應地減弱蛋白質和配基間的疏水作用，進而蛋白質被解吸附并從層析柱上洗脫下來。
2、加入有機溶劑
有機溶劑（如乙烯或丙二醇）的加入可以改變溶液的極性，從而可以干擾疏水作用。
3、提供鹽濃度（采用離液鹽）
離液鹽的加入可以干擾疏水作用。
4、加入去污劑
去污劑可以用做蛋白質置換劑，主要用于HIC純化膜蛋白。
在洗脫步驟中，將蛋白質從HIC填料上洗脫的zui常用方法是降低鹽濃度。用HIC純化新的蛋白質組分時，同樣首先采用該方法。上述其他方法的缺點在于，需要額外加入物質，而這些物質可能影響蛋白質的穩定性。但是，洗脫與填料結合比較緊密的蛋白質時，還是需要這些試劑的。
以下是月旭科技現有的HIC填料：
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