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為了不使被測物質和雜質停留在色譜柱中，在每次的樣品分析工作完成之后，都應及時地清洗色譜柱。首先要用對被測樣品洗脫能力強的溶劑來洗脫色譜柱，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例，因其先流出的物質是極性大的物質，此時應用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內的極性小的物質洗脫下來，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動相是緩沖溶液，則應先用蒸餾水來沖洗色譜柱，以沖掉柱內的鹽，然后再用合適的溶劑來沖洗。
凝膠濾過色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動相，用完之后當然要用蒸餾水來沖洗。如果是連續操作，可以將緩沖溶液置于柱內過夜，但最好是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對柱體的腐蝕。
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