2019-nCoV疫情牽動(dòng)著每一個(gè)人的心，目前除了一線疫情確認(rèn)在進(jìn)行大量檢測之外，溯源、復(fù)核、監(jiān)控疫情病毒變異的工作也在同步開展，在短期內(nèi)，中國科學(xué)家以非凡的速度，分離并解析了病毒全基因組序列，為進(jìn)一步分析其傳染機(jī)理，傳播途徑，藥物靶點(diǎn)等提供了支持，這一切的工作都離不開基于高通量測序的宏基因組病原體檢測。

宏基因組測序（mNGS）解析

宏基因組病原體檢測是對(duì)感染樣本進(jìn)行文庫構(gòu)建和高通量測序，通過病原數(shù)據(jù)庫比對(duì)，獲得致病微生物的種屬信息，對(duì)未知病原或已知變異較大病原進(jìn)行識(shí)別，為傳染病防控帶來新的思路并提供指導(dǎo)臨床治療的報(bào)告。

根據(jù)提取核酸的種類不同，宏基因組病原體檢測分為DNA檢測流程和RNA檢測流程。

DNA檢測流程適用于胞內(nèi)寄生的細(xì)菌如結(jié)核分枝桿菌、細(xì)胞壁較厚的真菌如隱球菌等病原的檢出。
RNA檢測流程適用于流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等RNA病毒的檢出。本次病毒鑒定即是通過宏基因組測序RNA流程進(jìn)行的。

宏基因組測序的臨床應(yīng)用

病原檢測：未知病原微生物增加了臨床診斷難度，無法進(jìn)行有效治療，導(dǎo)致患者病情加重甚至死亡。基于宏基因組學(xué)的測序在未知病原檢測中發(fā)揮日益重要的作用。

病原監(jiān)測與溯源：對(duì)特定地區(qū)或人群的臨床樣本進(jìn)行宏基因組學(xué)測序，監(jiān)測潛在致病病原，對(duì)可能出現(xiàn)的疫情進(jìn)行預(yù)測預(yù)警，對(duì)病原進(jìn)行追溯，找到潛在傳播途徑，及時(shí)確定和切斷傳染源。

宏基因組測序面臨的挑戰(zhàn)

高通量測序病原宏基因組檢測的前處理環(huán)節(jié)只涉及核酸提取和測序文庫構(gòu)建，不存在病原培養(yǎng)中出現(xiàn)的時(shí)滯，在病原微生物的檢測中有著明顯的優(yōu)勢，能夠更好應(yīng)對(duì)臨床病原診斷需求，但是也依然面臨不少挑戰(zhàn)，其中，測序文庫構(gòu)建關(guān)鍵并且難度大。

先天不足：病原樣本深藏在大量宿主和其它微生物之內(nèi)，臨床病原常為起始量低，背景噪音大的復(fù)雜樣本，大量宿主信號(hào)掩蓋了微量病原信號(hào)，致使敏感性偏低，難以有效區(qū)分。

后天潛憂：文庫構(gòu)建涉及到基因組打斷，測序接頭鏈接，全基因組擴(kuò)增等多個(gè)步驟，每一步驟的目標(biāo)是要每個(gè)分子都以相同的效率執(zhí)行每個(gè)步驟，打斷有損失，連接有差別，擴(kuò)增有偏好，都會(huì)帶來檢測誤差。

宏基因組檢測失敗的原因

核酸機(jī)械打斷，損失較大，導(dǎo)致潛在病原信息丟失
連接效率較低，文庫構(gòu)建中核酸分子多樣性和文庫復(fù)雜度的丟失，導(dǎo)致假陰性結(jié)果
建庫過程PCR步驟，特別是GC含量較高和較低的區(qū)段，擴(kuò)增不均一，覆蓋不到位

眾志成城 共克時(shí)艱

文庫構(gòu)建在宏基因組病原檢測中重要的指標(biāo)是核酸分子的復(fù)雜度和成庫產(chǎn)物的均一度，既要保證痕量目標(biāo)病原的存在，又要保證目標(biāo)病原不會(huì)因擴(kuò)增過程的不均勻性比例過低，在后續(xù)測序中被遺漏。

KAPA宏基因組測序產(chǎn)品應(yīng)用方案解析

宏基因組DNA檢測流程：KAPA Hyperplus酶切法DNA文庫構(gòu)建試劑盒，無需機(jī)械法打斷儀器，樣本損失量小，操作簡單，可根據(jù)測序長度，進(jìn)行片段大小調(diào)整，同時(shí)提供了更高的轉(zhuǎn)化效率及更低的擴(kuò)增偏差(KAPA HiFi)，從而獲得更均一的全局序列覆蓋度。

宏基因組RNA檢測流程：正常起始量樣本，推薦采用KAPA核糖體RNA去除試劑盒 (人/大鼠/小鼠)去除宿主rRNA，之后采用KAPA RNA Hyper文庫構(gòu)建試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建。對(duì)于微量樣本，則推薦利用SMART-seq2方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用KAPA HiFi擴(kuò)增cDNA，擴(kuò)增后的cDNA再采用 KAPA DNA Hyperplus進(jìn)行DNA文庫構(gòu)建。

KAPA DNA和RNA建庫產(chǎn)品目前已廣泛應(yīng)用在宏基因組病毒測序中，可參考文末文獻(xiàn)引用^[4]^[5]。

KAPA產(chǎn)品應(yīng)用亮點(diǎn)

復(fù)雜臨床病原樣本建庫效率高，確保病原的獲得^[2]
文庫擴(kuò)增覆蓋度、均一性好，PCR 重復(fù)度低，使得各種GC含量的病原均衡富集^[1]
宿主rRNA去除效率高，顯著減少背景噪音，將更多測序reads用于病原而非宿主^[3]
IVD級(jí)別質(zhì)控，產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定、批間差小，在大量各異的臨床樣本前表現(xiàn)穩(wěn)定
優(yōu)化建庫步驟，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，快速獲得文庫用于后續(xù)測序^[1]
完美兼容自動(dòng)化工作站建庫方案，規(guī)模化應(yīng)對(duì)疫

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文獻(xiàn)引用

1. Aigrain, L., Gu, Y., & Quail, M. A. (2016). Quantitation of next generation sequencing library preparation protocol ef?ciencies using droplet digital PCR assays-asystematic comparison of DNA library preparation kits for Illumina sequencing. BMC genomics.

2. Ring, J. D., Sturk-Andreaggi, K., Peck, M. A., & Marshall, C. (2017). A performance evaluation of Nextera XT and KAPA HyperPlus for rapid Illumina library preparation of long-range mitogenome amplicons. Forensic Science International: Genetics.

3. Herbert, Z. T., Kershner, J. P., Butty, V. L., Thimmapuram, J., Choudhari, S., Alekseyev, Y. O., ... & Gillaspy, A. (2018). Cross-site comparison of ribosomal depletion kits for Illumina RNAseq library construction. BMC genomics.

4. Deng, Y., Cai, W., Li, J., Li, Y., Yang, X., Ma, Y., ... & Sun, M. (2019). Evaluation of the genetic stability of Sabin strains and the consistency of inactivated poliomyelitis vaccine made from Sabin strains using direct deep-sequencing. Vaccine.

5. Grubaugh, N. D., Ladner, J. T., Kraemer, M. U., Dudas, G., Tan, A. L., Gangavarapu, K., ... & Prieto, K. (2017). Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature.

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