目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC0985-100T/96S乙酰輔*A含量檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100T/96S |
| 貨號 | BC0985 | 應用領域 | 醫療衛生,環保,化工,生物產業,農林牧漁,綜合 |
| 主要用途 | 測定意義：乙酰輔*A廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中。是生物體能源物質代 |
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0985
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體0.6 mL×2支 | -20℃保存 |
試劑一 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑二 | 液體5 μL×2支 | 2-8℃保存 |
試劑三A | 液體25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三B | 粉劑×2瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑一：臨用前加入163μL試劑四，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；
2、 試劑二：臨用前取1支先將液體甩離至管底，然后加入125μL試劑四，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；
3、 試劑三：臨用前取1瓶試劑三B加入12mL試劑三A，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；
4、 工作液：臨用前將試劑一、二和三按照1:1:90的比例混合，根據樣本量現配現用。
產品說明：
乙酰輔*A廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是生物體能源物質代謝過程中產生的一種重要的中間代謝產物，在體內能源物質代謝中是一個樞紐性的物質。糖、脂肪、蛋白質三大營養物質通過乙酰輔*A匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環和氧化磷酸化，經過這條通路氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于ATP合成。此外，乙酰輔*A是合成脂肪酸、酮體、膽*醇及其衍生物等生理活性物質的前體物質。
蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD+生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔*A和草酰乙酸生成檸檬酸和輔*A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯反應，乙酰輔*A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反應了乙酰輔*A含量的高低。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、天平、水浴鍋/恒溫培養箱、臺式低溫離心機、微量石英比色皿/96孔UV板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：建議稱取約0.1g樣本，加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二進行冰浴勻漿。于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。
2. 細胞或細菌：建議取500萬細胞或細菌加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200w，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。
3. 血清（漿）或其他液體：直接檢測，若液體有渾濁則離心后測定。
二、測定步驟
1. 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，分光光度計蒸餾水調零。
2. 將工作液37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）預熱10min。
3. 取50μL樣本和205μL工作液至微量石英比色皿或96孔UV板，混勻，立即記錄340nm處20s的吸光值A1和80s時的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。
三、乙酰輔*A含量計算
A、使用微量石英比色皿測定
1. 按樣本質量計算
乙酰輔*A含量（nmol/g 質量）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×109÷V樣×V提÷W×F=819.9×ΔA÷W×F
2. 按照細胞數量計算
乙酰輔*A含量（nmol/104 cell）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×109÷V樣×V提÷500×F=1.640×ΔA×F
3. 按液體體積計算
乙酰輔*A含量（nmol/mL）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×109÷V樣×F=819.9×ΔA×F
ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；109：單位換算系數，1mol=109nmol；V反：反應總體積，2.55×10-4L；V樣：加入樣本上清體積，0.05mL；V提：加入提取液一和提取液二的總體積，1mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌數量，500萬；F：稀釋倍數。
B、使用96孔UV板測定
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進行計算即可。
實驗實例：
1. 稱取0.1g兔腎加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二進行勻漿研磨，離心后取上清，稀釋2倍后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA= A2-A1=0.8083-0.7691=0.0392，按樣本質量計算酶活得：
乙酰輔*A含量（nmol/g 質量）＝819.9×0.0392÷0.1×2=642.8 nmol/g 質量。
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