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QQ交談關于酶切的有用知識-紅外線滅菌器技術文章
點擊次數：5856 發布時間：2013-12-10
關于酶切的有用知識-紅外線滅菌器技術文章
酶切是分子生物學中常用的，如何選擇酶切緩沖液，提高酶切效率，是一個十分關鍵的問題，本人摘用了其它論壇的內容，另外將逐步整理，使酶切問題能夠比較容易解決，希望大家補充：
PCR產物的酶切。
PCR產物的酶切與引物上引入的保護堿基有很大的關系，所以設計引物的時候就應該注意到這一點，如何選擇保護堿基，具體參見NEB上關于保護堿基的資料:
2.加了保護堿基可能也會遇到切不動的問題，切不動可以從以下方面考慮：（1）酶切緩沖液、
每種酶都有公司提供的*緩沖液，它們的差別只是離子濃度與體系的不同，如Na、k、Mg等，還有PH值及緩沖體系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油
和DTT作為保護劑。在雙酶切的時候常會遇到兩種酶有各自的緩沖液，要達到高酶切效率，選擇是個問題，如果酶切時間和量足夠，解決的方法：
（A）使用其中一個酶的緩沖液，但要考慮到另一酶的反應效率，反應效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率參數，具體見公司，如NEB提供了很好的buffer參數:
（B）
使用它們的通用的緩沖液，使兩種酶在同一緩沖液里達到也足夠的酶切效率；沒有通用的BUFFER怎么辦呢？
分兩次酶切。即先用一種酶切，膠回收后再用另一種酶切。一般先低鹽后高鹽，這種方法保證了在各自的酶切緩沖液中都得到zui大的酶切效率，但缺點是要回收，損
失大 ；
（C）克隆到T載體中，值得推薦的方法，克隆到T載體中，不須要考慮受這個條件的限制，酶切位點也可以用T載體上自帶的。
（2）酶切溫度。酶切溫度也很重要，一般的酶切zui適溫度為37度，有些特殊的酶的反應溫度不同，如Sma Ⅰ為30度。雙酶切時這種情況下分開切，先低溫后高溫。
（3）酶切時間。酶切時間直接影響到酶切是否*，一般為1-3h，這個時間已經足夠，對于一些活性較好的酶，30min就可以酶切*，建議在酶切1h后取5ul跑電泳以鑒定酶切效率；PCR產物的酶切時間較長，一般24小時。
（4）酶失活。如
果使用酶解凍后放置太久，可能導致酶失活。這種情況較少見，只能換新酶。如果拿了不同公司的酶，buffer也不一樣，怎么辦？放心，可以用不同公司的酶
進行雙酶切，一般不會有問題的。可以先查查NEB的酶在不同緩沖液中的活性百分比，選擇它們都有適中活性的buffer，每個公司生產的酶反應緩沖液針對
特定內切酶是zui合適的！
（5）酶切體系。選用多大的酶切體系取決于你的樣品濃度，在雙酶切的時候為了得到質量高的電泳圖，尤其插入的是小片段DNA，酶切后產物量較少，可以增加酶切重組DNA的量和增加上樣量，建議酶切前測定一下DNA濃度或跑電泳看看DNA有多濃，做到心中有數。