一．“兔子膠原酶II(Collagenase II)ELISA試劑盒”實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗C3抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗C3抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的C3呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。

二．實驗材料與試劑配制

1.儀器與材料：酶標儀（使用前預熱30分鐘），微量加液器、吸頭、蒸餾水或去離子水，濾紙。

2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液備用。

三．樣品收集、處理及保存

1）.細胞培養上清：

適用于檢測體外培養的細胞分泌性成份。用無菌管收集細胞上清液，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

2）細胞：

用PBS反復洗滌細胞3次，調整細胞濃度達到104-106/ml 左右，通過反復凍融，使細胞破壞并放出細胞內成份，或者細胞超聲粉碎，離心取上清液檢測。

3）血清：

在室溫下，血液自然凝固，以1000×g離心15分鐘，取上清待測。

4）血漿：

應根據標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合后靜置10-20 分鐘后，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

5）體液：

包括胸腹水、腦脊液，分泌物等。使用不含熱原和內毒素的離心管收集，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

6.）組織標本：

切取組織標本，稱取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或勻漿器，或超聲破碎儀將標本勻漿，以2000-3000 rmp離心20 分鐘，收集上清進行檢測。

樣品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

7）保存：

如果樣品不能立即檢測，應將其分裝，-70 ℃保存，避免反復冷凍。保存過程中如出現沉淀，應再次離心。血液標本盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

四．“兔子膠原酶II(Collagenase II)ELISA試劑盒”操作步驟

1）取出試劑盒，室溫（20-25℃）放置30分鐘。

2）分組：取出96孔板，根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數，把剩余的板條繼續冷藏處理。分別設標準品組（6個濃度）、空白孔、待測樣品組。

3）標準品的稀釋：準備小試管6 只，依次編好號碼，先在各小試管中加入標準品稀釋液100ul，然后取原濃度標準品100ul加入一只已編好號的試管中，充分混勻;再在該試管中取100ul 加入第二支試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第三只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第四只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第五只試管中，充分混勻；然后在該試管中取100ul，棄掉。第六只試管作為0 號標準品。

注：為減少實驗誤差，保證準確性，建議設置復孔。

4）加樣：依照標準品的順序分別加入50ul的標準品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入50ul的蒸餾水；其余微孔中先加樣品40ul然后再加生物素標記的抗體10ul。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

5）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

6）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒棄去，如此重復5 次，拍干。

7）加酶標溶液：標準品組、待測樣本組各孔中加入50ul的酶標溶液（空白對照孔除外）。

8）溫育：酶標板用封板紙密封后，放入濕盒內于37℃恒溫孵育1小時。

9）洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置15-30s，充分清洗酶標板5次，用吸水紙*拍干。

10）顯色：各孔加入顯色劑A液50ul后，再加入顯色劑B液50ul。

11）終止：25-37℃下避光反應10-15分鐘，加入50ul終止液。

12）讀板：在450nm波長讀取各孔的OD值。

注：讀板時必須拭干板底殘留的液體和手指痕跡，讀板時間控制在終止反應后的30分鐘內，以免影響準確性。

五．洗板方法
1.  手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。
2.  自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人C3，且與其它相關蛋白無交叉反應。

六．注意事項

1）實驗操作中必須使用一次性吸頭，避免交叉污染。

2）加樣：加樣時，要控制加樣速度，避免*孔與zui后一孔間的時間間隔過大，否則將會導致不同的預孵育時間，從而影響實驗的準確性以及重復性。

3）孵育：嚴格按照說明書上規定的孵育時間和溫度進行。

反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化，如果顏色較深，請提前加入終止液終止反應。

4）建議實驗前預測樣品含量，如樣品濃度過高，應對樣品進行稀釋，計算結果時乘以相應的稀釋倍數。

5）建議使用本試劑盒時先做預實驗（即先做標準曲線，試用幾個標本），如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經銷商，如果因運輸過程導致試劑盒失效，可要求調換，但概不承擔產品本身以外的任何損失。

七．ELISA試劑盒的性能：
準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值，大于等于0.9900。
靈敏度：zui低檢測濃度小于10 pg/ml。
特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
重復性：板內、板間變異系數均小于15%。

八.ELISA試劑盒實驗操作的常見問題：

1. 問--客戶用48T試劑盒，大概只有十個樣所以他一次用不完那么多板條，但是他想做兩次，可封板膜只有一張，那如果用完了怎么辦？可以用什么別的東西取代嗎？

答--可以把封板膜剪掉，用多少剪多少也可以用封口膜替代。
2. 問--實驗過程中溫育是放在哪溫育呢？
答--可以在水浴箱、細胞培養箱和烘干箱里面都行，只要恒定溫度為37度。

九．“兔子膠原酶II(Collagenase II)ELISA試劑盒"訂貨說明

1）賣方確保所訂產品與目錄技術指標保持*；

2）為了確保買方產品在運輸中的質量，對有特殊要求的低溫產品予以濕冰運輸。

3）收到貨物后如出現質量問題，買方需在收到貨物一個月內向賣方提出書面異議。買方逾期不提出異議，視為貨物符合其要求，賣方不付任何責任。

4）出現質量以外的問題，如破損等，買方應在收貨后一個周內提出。買方未按時提出異議，視為該產品合格。

本公司對所有售出的產品保證質量，并提供良好的售后服務，有關產品質量的投訴，請在收到貨物的32天內以書面形式提出，并向我公司技術人員提供相應的材料，我們會及時派人解決。所有形式的賠償或退換僅限于產品本身，不涉及其他間接內容。凡購買本公司任意款elisa試劑盒，均可享受免費代測服務，并提供技術指導。